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光度計的設計原理

時間:2018-09-27 浏覽次數:350

   光度計的設計原理
  事實上,光度計的設計原理和工作原理,允許吸光值在一定範圍内變化,即儀器有一定的準确度和度。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動,都是正常的。另外,還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩沖液的pH值,離子濃度等:在測試時,離子濃度太高,也會導緻讀數漂移,因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,如TE,可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在幹擾測試效果。為了大程度減少顆粒對測試結果的影響,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值在0.1-1.。在此範圍内,顆粒的幹擾相對較小,結果穩定。從而意味着樣品的濃度不能過低,或者過高。是操作因素,如混合要充分,否則吸光值太低,甚至出現負值;混合液不能存在氣泡,空白液無懸浮物,否則讀數漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品,否則濃度差異太大;換算系數和樣品濃度單位選擇一緻;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達到比色杯要求的小體積等多個操作事項。
  核酸的定量是光度計使用頻率高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,單鍊、雙鍊DNA,以及RNA。核酸的高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構成不一,因此其換算系數不同。定量不同類型的核酸,事先要選擇對應的系數。如:1OD的吸光值分别相當于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。測試後的吸光值經過上述系數的換算,從而得出相應的樣品濃度。測試前,選擇正确的程序,輸入原液和稀釋液的體積,爾後測試空白液和樣品液。然而,實驗并非一帆風順。讀數不穩定可能是實驗者頭痛的問題。靈敏度越高的儀器,表現出的吸光值漂移越大。
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